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自噬调控剂对小鼠体内弓形虫增殖的影响

发布时间:2016-8-4      来源:admin      阅读次数:452

张琼1  张婧2  高劲松1  李万峰1  汪学龙2

1.长沙医学院病原生物学教研室,湖南 长沙   410219    2.安徽医科大学病原生物学教研室,安徽 合肥  230032

摘要  目的  研究自噬调控剂对小鼠体内弓形虫增殖的影响。方法  建立弓形虫感染的小鼠模型,分别使用自噬抑制剂巴弗洛霉A1(bafilomycin A1)和自噬诱导剂氯化锂对弓形虫感染小鼠模型进行干预,应用荧光定量PCR检测不同实验条件下弓形虫数量。结果  实验结果表明巴弗洛霉素A1剂量与小鼠体内弓形虫数量呈负相关,而诱导剂氯化锂与小鼠体内弓形虫数量呈正相关。结论  调控宿主细胞自噬可调控体内弓形虫增殖。

关键词:弓形虫;自噬调控剂;荧光定量PCR;增殖;小鼠

Influence of Autophagy Regulation Agent on the Proliferation of Toxoplasma Gondii in Mice

ZHANG Qiong1#, ZHANG Jing2#, GAO Jin-song1,Li Wan-feng1,Wang Xue-long2

(1 Changsha medical university, Changsha, Hunan, 410219, China; 2Anhui medical university,   Hefei, Anhui, 230032, China)

ABSTRACT Objective: Using autophagy inhibitors, accelerators to judge the role of autophagy in the replication process of Toxoplasma gondii proliferation. Methods: using autophagy inhibitors and inducers of autophagy, Toxoplasma infection in a mouse model was intervened respectively. Fluorescence quantitative PCR was used to detect proliferation of Toxoplasma gondii under different experimental conditions. Results: Quantitative PCR results showed that bafilomycin A1 dose and the number of mice in vivo Toxoplasma was negative correlation, while inducing agent lithium chloride and the number of mice in vivo Toxoplasma gondii was positive correlation. Conclusion: The regulation on autophagy of host cellsin mice could regulate the proliferation and replication of Toxoplasma gondii.

Key words: Toxoplasma gondii; Autophagy regulation agent; Fluorescence quantitative PCR; Proliferation; Mice

 

弓形虫病是由专性细胞内寄生的弓形虫引起的一种人兽共患寄生虫病,广泛流行于我国和世界各地。细胞凋亡是病原体与宿主细胞相互作用的结果,也是病原体一种重要的致病机制。弓形虫感染和细胞凋亡之间的关系复杂,在被感染机体内既可以抑制细胞凋亡也可以促进细胞凋亡[1,2]

近来Ⅱ型程序性细胞死亡——自噬性细胞死亡研究获得众人的迅速关注。已有的对自噬在弓形虫感染中作用的研究显示,一、进入细胞内的弓形虫可通过细胞自噬的降解作用被清除,以保护未感染的正常细胞;二、自噬参与弓形虫感染复制过程,抑制了宿主细胞自噬就抑制了弓形虫的增殖 [3]。目前对细胞自噬在弓形虫感染、增殖并致病中的作用尚未阐明。本实验拟通过建立弓形虫感染小鼠模型,分别使用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1、促进剂氯化锂对弓形虫感染小鼠模型进行干预,应用荧光定量PCR检测不同实验条件下弓形虫的增殖情况,并监测各组小鼠的存活情况。

1  材料和方法

1.1主要试剂及仪器  自噬抑制剂Bafilomycin A1、自噬诱导剂氯化锂购于美国sigma公司;PUREGENE DNA 提取试剂盒购于美国Gentra公司;SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒购于TaKaRa公司。DNA 梯度扩增仪购于德国 Biometra 公司。

1.2虫株和实验动物 弓形虫RH株(绿色荧光蛋白GFP),虫株由国外进口,昆明小鼠(5-7周龄,雌性,体重约20g),由安徽医科大学病原生物学教研室与安徽省实验动物中心提供。

1.3  实验分组  随机将24只小鼠分为4组,依次为弓形虫感染模型组(3只,只感染弓形虫),实验组1(9只,先感染弓形虫,后注射Bafilomycin A1),实验组2(9只,先感染弓形虫,后注射氯化锂),空白对照组(3只,只注射PBS)。用腹腔注射的方式用弓形虫速殖子RH株对3组小鼠进行弓形虫感染实验,剂量103 /鼠,空白对照组腹腔注射PBS。在弓形虫感染小鼠后1d,实验组1的小鼠每天腹腔注射自噬抑制剂Bafilomycin A1,剂量按10mmol/L分别用PBS 1:100稀释后注射1ml(3只)、400ul(3只)、100ul(3只),实验组2的小鼠每天腹腔注射自噬诱导剂氯化锂,剂量按10mmol/L分别用PBS 1:100稀释后注射1ml(3只)、400ul(3只)、100ul(3只)。

1.4  弓形虫DNA的提取  注射Bafilomycin A1和氯化锂的小鼠在48h后,分别取各组小鼠3只,颈椎脱臼处死,用生理盐水冲洗腹腔, 收集腹腔液。各组每只小鼠分别取300uL腹腔液用PUREGENE DNA 提取试剂盒提取弓形虫DNA。

1.5  荧光定量PCR检测引物设计与合成  据在线GenBank数据库上弓形虫各株的 B1 基因通过BLAST比对后,使用Primer 5.0软件设计荧光定量PCR 引物:目的片断选在 B1 基因的第 185~ 407位,上、下游基因分别为(5c- TCCTTCGTCCGTCGTAAT -3c)和(5c- TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3c),扩增片段大小为223 bp。上述引物由上海生物工程股份有限公司合成。

1.6  荧光定量PCR反应体系与条件  采用荧光染料SYBR Greenl在ABI Prism 7300上进行。荧光定量PCR反应体系(20 μl):模板 2.0μl;上游引物(10 μmol/L)0.4 μl;下游引物(10 μmol/L)0.4 μl;SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μl;ROX Reference Dye (50×) 0.4 μl;dH2O 6.8 μl。PCR程序:PCR扩增,50℃ 2 min;95 °C预变性1 min;95℃ 15 s;60℃ 31s,35个循环;并添加熔解曲线。

1.7各组小鼠的存活情况监测: 随机取40只小鼠按1.3实验分组及处理方法,监测各组小鼠的生存状态及存活情况。

1.8 数据处理与分析 

利用GraphPrism5.0软件进行数据分析与统计。

2  结果

2.1定量标准曲线的建立

经过摸索,用方法描述的作为最佳扩增条件进行定量扩增,起始模板为(109~104 )copies/ul时线性较好,循环阈值与模板浓度之间的相关系数为0. 997。

 

2.2荧光定量PCR结果

实验组1小鼠注射自噬抑制剂巴弗洛霉素A1后,体内弓形虫数量与自噬抑制剂剂量呈负相关,其中高剂量组与弓形虫模型组差异显著(P<0.01),说明巴弗洛霉素A1通过对自噬的抑制对体内弓形虫的增殖有抑制作用;相反,实验组2小鼠注射自噬诱导剂氯化锂后,体内弓形虫数量与自噬诱导剂剂量呈正相关,其中高剂量组与弓形虫模型组差异显著(P<0.01),说明诱导自噬可促进体内弓形虫的增殖。如图1显示。

图1药物干预结果

注:图中倍数表示弓形虫的相对数量。

2.3药物处理后小鼠生存情况

由实验结果可见,实验组1小鼠注射自噬抑制剂后,生存时间明显延长,说明高剂量巴弗洛霉素A1通过对自噬的抑制作用发挥了抑制弓形虫增殖的作用;相反,实验组2小鼠注射高剂量自噬诱导剂氯化锂后,生存时间明显缩短,说明诱导自噬可促进弓形虫的增殖。如图2显示各组小鼠成活率。

 

 

 
 

 

图2各组小鼠存活率

3  讨论

细胞自噬是病原体一种细胞内重要的平衡机制,在细胞质的酸性溶酶体降解废物成分,作为细胞自噬目标的细胞质中的多余部分是细胞器和蛋白质的组成成分[4]。自噬发生过程中,自噬体与溶酶体相互融合成自噬溶酶体降解其内的各种细胞器, 使大量酸性囊泡聚积[5]。巴弗洛霉素A1是一种可酸化自噬体内囊泡物质的H+-ATP 酶质子泵抑制剂, 而 H+-ATP 酶是溶酶体发育成熟的关键酶, 巴弗洛霉素A1抑制囊泡酸化进而抑制自噬体后期形成。现有的文献报道表明弓形虫感染早期为抑制宿主细胞凋亡,促进宿主细胞自噬,降解宿主细胞自身不重要的细胞器提供蛋白质等营养成分,有利于弓形虫自身繁殖复制;弓形虫感染晚期自噬被过分的激活,宿主细胞体内细胞器已严重损耗,就会诱发细胞凋亡,最终导致宿主细胞裂解,促进体内弓形虫在宿主细胞中的增殖扩散。在弓形虫感染的过程中,通过影响宿主细胞自噬信号通路很可能改变弓形虫的增殖及其致病效应。在本实验中发现在弓形虫感染后,给予巴弗洛霉素A1后弓形虫数量明显减少,而且与剂量呈负相关,它能明显延长小鼠存活时间,说明巴弗洛霉素A1可以通过抑制自噬来间接抑制弓形虫的增殖,具体机制尚有待研究。

实时荧光定量PCR已被广泛应用于基因、病原体检测的众多领域中,因为其具有高精度,高灵敏度,宽泛的检测范围,重现性好以及无PCR后处理等优势[6,7]。本实验设计扩增的靶基因是 B1 基因,在弓形虫不同分离株中具有高度保守性[8,9]。从定量标准曲线可以得出,不同拷贝数的对数值与CT值之间有较好的线性关系,且方法的重复性好。巴弗洛霉素A1高剂量组与弓形虫模型组差异显著的检测结果说明了自噬抑制剂通过抑制宿主细胞自噬从而抑制弓形虫的增殖。小鼠的存活率检测结果也表明与只感染了弓形虫组比较,注射了氯化锂的小鼠生存天数明显减短,说明自噬诱导剂可促进体内弓形虫的增殖。表明了调控自噬可以调控弓形虫在小鼠宿主体内的增殖。

本研究是首次对细胞自噬在弓形虫感染、增殖并导致临床疾病中所起的作用进行探索,国内外尚无类似报道。本研究结果将有助于了解细胞自噬在弓形虫感染增殖中的作用,并为有效的预防和治疗弓形虫感染提供新途径。

参考文献:

1. Subauste CS. CD40 autophagy and Toxoplasma gondii[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz.,2009, 104(2):267-272.

2. 李祥瑞. 弓形虫病流行的新趋势.动物医学进展[J].2010, 31(S1): 234-6.

3. Subauste CS. Autophagy in immunity against Toxoplasma gondii[J].Curr Top Microbiol Immunol,2009, 335:251-265.

4. Contopoulos-Ioannidis DG, Maldonado Y, Montoya JG. Acute Toxoplasma gondii Infection among Family Members in the United States[J].Emerging infectious diseases, 2013, 19(12): 1981-4.

5. Kuballa P, Nolte WM, Castoreno AB, Xavier RJ. Autophagy and the immune system[J]. Annual review of immunology, 2012, 30: 611-46.

6. Shi C-S, Kehrl JH.. TRAF6 and A20 regulate lysine 63-linked ubiquitination of Beclin-1 to control TLR4-induced autophagy[J].Science signaling, 2010, 3(123): ra42.

7. Delgado MA, Elmaoued RA, Davis AS, Kyei G,, Deretic V. Toll‐like receptors control autophagy[J]. The EMBO journal, 2008, 27(7): 1110-21.

8. Bell A S , Ranford Cartwright L C . Real time quantitative PCR in parasitology [J] . Trends Parasitol,2002 , 18( 8) : 337-342 .

9.Reischl U , Bretagne S, Krugen D, et al. Comparison of two DNA target for the diagnosis of toxoplasmosis by rea-l time PCR using fluorescence resonance energy transfer hybridization probes[J] . BMC Infect Dis, 2003, 3: 1- 9.

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